//
you're reading...
Mikrobiologi Tanah dan Bioteknologi Tanaman 1

Semester 3. Teknik Southern Blot Dalam Rekayasa Genetika Bakteri.

Daftar Isi

Bab      1          : Pendahuluan

1.1              Latar Belakang………………………………………………………………………………..    3

1.2              Tujuan…………………………………………………………………………………………….   5

Bab      2          : Hasil dan Pembahasan……………………………………………………………….       6

Bab      3          : Kesimpulan……………………………………………………………………………….       12

Bab      4          : Daftar Pustaka……………………………………………………………………………………. 13

Bab I

Pendahuluan

1.1              Latar Belakang

Blot adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA atau DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi. Keuntungan teknik adalah ;

a.    Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan lembaran dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel atau matriks

b.    Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan

c.     Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi, mencuci, dll dapat lebih singkat

d.    Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan sebelum dianalisis

e.    Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak metode analisis yang dipakai

f.    Matriks

Matriks yang biasa dipakai dapat berupa nitroselulosa (NC). Namun NC juga memiliki kekurangan, yaitu beberapa komponen yang memiliki afinitas lemah dapat hilang selama pemrosesan.  Matriks lain yang dapat digunakan untuk menutupi kekurangannya yaitu kertas diazobenzyloxymethyl (DBM). Ada pula kertas lain, yaitu diazophenylthioeter (DPT)

Beberapa Metode blot yang ada

  1. Southern bLot

Southern blot pertama kali dikemukakan oleh Southern (1975).  Teknik ini mentransfer DNA ke kertas NC dengan menggunakan prosedur aliran pelarut. Caranya yaitu dengan menempatkan gel  elektroforesis ke kertas matriks yang direndam buffer dan berada di atas sesuatu seperti spons yang telah dibasahi dengan buffer. Membran tersebut diletakkan di atas gel dan ditumpuk pula beberapa kertas peresap di atasnya.  Buffer kemudian akan mengalir pelan-pelan ke membran, demikian pula dengan gel yang membawa molekul ke kertas membran, sementara gelnya diserap oleh kertas peresap. Fragmen DNA yang spesifik dideteksi dengan menggunakan pelacak. Pelacak biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida. Lokasi sinyal yang terlihat setelah autradiografi membuat kita dapat menentukan ukuran dari fragmen DNA tersebut.

  1. Northern Blot

Tekniknya sama dengan Southern Blot, namun menggunakan kertas DBM dan biasanya mendeteksi RNA.

  1. Eastern  Blot

Teknik ini ditemukan oleh Reinhard dan Malamud (1982), merupakan proses transfer bidirectional dengan menggunakan aliran pelarut protein dari gel ke NC berdasarkan titik isoelektrik.

  1.  Western Blot

Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette dan dinamai western blot sebagai olok-olokan terhadap tekini southern blot yang pertama kali ditemukan.

Western blot merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik pada sampel jaringan yang homogenat ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan dengan antibodi. Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian akan dilacak dengan menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target.

Western blot dapat mendeteksi suatu protein dalam kombinasinya dengan sangat banyak protein lain, dapat memberikan informasi mengenai ukuran dan ekspresi protein tersebut.

1.2              Tujuan

Mengetahui tentang metode blotting pada rekayasa genetika bakteri, khususnya Southern Blot. Selain itu, bertujuan untuk memahami mekanisme kerja dari Southern Blot serta pengaplikasiannya.

Dalam hal ini, dengan mengambil studi kasus teknik Soutern Blot pada bakteri “Klebsiella pneumoniae M10” , bertujuan untuk mengetahui jenis protein produk dari gen-gen yang bertanggungjawab terhadap terjadinya resistensi terhadap antibiotika BRL 41897A, selanjutnya dengan hasil tersebut dilakukan usaha untuk mendesain antibiotika baru turunan dari BRL 41897A yang diharapkan dapat mencegah munculnya jenis bakteri bakteri baru yang resisten terhadap antibiotika turunan BRL 41897A tersebut. 

Bab II

Hasil Pembahasan

Southern blotting adalah teknik bernama setelah penemu dan pengembang, ahli biologi Inggris Edwin M. Selatan pada tahun 1975. Southern blotting adalah teknik yang memungkinkan deteksi sekuens DNA tertentu (gen atau lainnya) dalam besar, kompleks sampel DNA (misalnya DNA seluler).

“Sebelum PCR dan sequencing murah cepat berubah pandangan kita tentang alam semesta yang genetika, Southern Blot adalah pekerja keras yang universal. Tidak ada eksperimen dalam genetika molekular yang tidak pada tahap tertentu menggunakan Southern Blot. Hal ini masih merupakan alat yang berguna dan Anda perlu tahu tentang hal itu sehingga Anda dapat menafsirkan data historis.

Southern Blotting Procedure

Diagram of the Southern blot technique.Figure is Copyright. If you would like to use it for a lecture or science project, please contact us for permission.

Pada Langkah 1, DNA dicerna dengan pembatasan endonuklease. Tinggi berat molekul DNA dicerna menjadi fragmen – fragmen yang lebih kecil.

Pada Langkah 2, DNA ini kemudian dipisahkan oleh ukuran dengan elektroforesis pada gel agarosa.

Pada Langkah 3, selembar membran nilon atau nitroselulosa (ungu) ditempatkan di atas gel agarosa dalam larutan buffer. Ini dianggap sebagai blotting atau mentransfer panggung. Tekanan diberikan secara merata ke gel baik menggunakan sedotan atau dengan menempatkan tumpukan kertas handuk dan berat di atas membran dan gel untuk memastikan bahkan kontak antara gel dan membran. Buffer transfer oleh kapiler dari wilayah potensi air yang tinggi kepada daerah potensial air rendah (biasanya kertas filter dan kertas tisu) yang kemudian digunakan untuk memindahkan DNA dari gel ke membran. Membran bermuatan positif (ungu) biasanya digunakan yang memungkinkan DNA untuk mengikat dengan afinitas tinggi untuk ion membran melalui interaksi antara bermuatan negatif DNA dan membrane bermuatan positif.

Pada Langkah 4, nitroselulosa membran dipanggang oleh paparan suhu tinggi (60-100 ° C). Membran nilon terpapar radiasi UV. Langkah-langkah ini digunakan untuk memastikan permanen dan kovalen crosslink DNA hadir dalam band ke membran.

Pada Langkah 5, membran dihadapkan pada radiolabeled probe. Probe ini beruntai tunggal fragmen DNA yang memiliki urutan minat Anda yang ingin Anda mendeteksi. Probe ini diinkubasi dengan membran dan diperbolehkan berhibridisasi dengan DNA pada membran. Probe biasanya radiolabeled sehingga mereka dapat dideteksi pada film, namun baru juga digunakan probe yang non-radioaktif seperti neon atau chromogenic pewarna. Setelah hibridisasi, kelebihan terikat probe dicuci jauh dari membran,meninggalkan probe terikat secara khusus.

Pada Langkah 6, pola hibridisasi dideteksi oleh visualisasi pada film sinar-X oleh autoradiografi dalam kasus radioaktif atau fluorescent probe, atau perkembangan warna pada membran jika metode deteksi chromogenic dimanfaatkan.

(Catatan untuk Langkah 3: Jika besar fragmen-fragmen DNA yang hadir lebih besar dari 15 kb dalam ukuran dapat depurinated oleh maka asam HCl encer sebelum blotting yang akan memecah DNA menjadi potongan-potongan yang lebih kecil, lebih efisien sehingga memungkinkan transfer dari gel ke membran. Jika Metode transfer basa digunakan, DNA gel dimasukkan ke dalam larutan alkali (biasanya mengandung natrium hidroksida) untuk mengubah sifat sesuatu benda untai ganda DNA. The denaturasi dalam situasi alkaline menyediakan untuk peningkatan pengikatan DNA yang bermuatan negatif ke membran bermuatan positif, memisahkannya ke dalam untai DNA tunggal untuk kemudian hibridisasi dengan probe (lihat di bawah), dan menghancurkan setiap residu yang mungkin masih RNA hadir dalam DNA.

Studi Kasus

Laporan terdahulu telah menjelaskan tentang rangkaian DNA dari fragmen KIH 19 (Gambar 1) dalam plasmid yang membawa fragmen DNA sebelah kanan TnphoA dari gen yang berperan dalam resistensi mutan

K.pneumoniae KSL19 terhadap antibiotika BRL 41897A (Kuswandi, 2004). Plasmid yang berisi klon KIH19 kemudian dipotong dengan enzim HindIII dipakai sebagai probe untuk mendeteksi fragmen yang sama didalam kromosom K.pneumoniae M10. Hasil Southern blot dari klon fragmen DNA yang sama dengan KIH19 didalam strain M10 ( Gambar 2).

Melakukan kloning fragmen yang membawa gen utuh

Didalam usaha untuk mengklon fragmen yang positif sama dengan KIH19 diatas dari strain K.pneumoniae M10, dipakai cara yang sama seperti pembuatan plasmid yang mengandung KIH19, yaitu memasukkan fragmen seperti yang terlihat pada Gambar 2 kedalam plasmid PUC18. Koloni rekombinan yang dihasilkan dianalisa dengan elektroforesis gel dan Southern blot dengan memakai probe fragmen KIH19. Klon yang didapat disebut M19, dimana didalamnya diharapkan membawa sebagian atau seluruh gen yang utuh yang bertanggung jawab terhadap terjadinya resistensi terhadap BRL 41897A. Beberapa klon yang membawa M19 memberikan hasil positif pada analisis Southern blot dengan probe KIH19 (Gambar 3).

DNA didalam plasmid yang positif kemudian diisolasi, dianalisis dengan Southern blot kemudian dilakukan sequencing menggunakan primer berasal dari data KIH19. Primer tersebut berdasar data sequencing yang terletak disebelah kiri TnphoA adalah CGAGTCAGATATTGTGACC dan AAA GGCGGGTTGAC, yang terletak 66 pasang basa dari ORF), diperbanyak dengan PCR..

Hasil PCR dari fragmen DNA dianalisis dengan elektroforesis gel (Gambar 4). Rangkaian DNA dari M19 memberikan hasil yang jelas menunjukkan bahwa didalamnya memuat gen yang bertanggung jawab terhadap BRL 41897A, hal tersebut dikonfirmasi dengan rangkaian DNA yang sama dengan rangkaian DNA pada KIH19 dan lokasi titik dimana transposon TnphoA menyisip didalam gen tersebut pada mutan KSL19. Gen tersebut, disebut ksl19, selain menunjukkan adanya Start Codon dan Stop Codon, juga membawa rangkaian Signal Sequence dan daerah yang akan menjadi RBS (Ribosome Binding Site) pada mRNA (Gambar 5).

Komplementasi

Dalam usaha untuk meng karakterisasi klon M19 maka dilakukan analisis lebih lanjut. Pertama dilakukan transformasi fragmen M19 kedalam sel K. pneumonia mutan KSL19, hasil transforman disebut T19. Transformandianalisis dengan elektroforesis gel dapat dilihat pada Gambar 6.

Uji sensitivitas bakteri terhadap BRL 41897A Setelah diperoleh transforman T9, kemudian dilakukan uji sensitivitas transforman terhadap antibiotika BRL 41897A dibandingkan dengan strain Wild Type M10 dan mutan KSL19. Hasil uji sensitivitas, pada Tabel, menunjukkan bahwa plasmid M19, dimana

didalamnya terdapat gen ksl19, dapat mengubah mutan KSL19 yang resisten terhadap BRL 41897A menjadi strain baru (transforman T19)yang sensitif terhadap antibiotika tersebut.

Bab III

Kesimpulan

Blot adalaah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA atau DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi.

Southern blot pertama kali dikemukakan oleh Southern (1975).  Teknik ini mentransfer DNA ke kertas NC dengan menggunakan prosedur aliran pelarut. Caranya yaitu dengan menempatkan gel  elektroforesis ke kertas matriks yang direndam buffer dan berada di atas sesuatu seperti spons yang telah dibasahi dengan buffer. Membran tersebut diletakkan di atas gel dan ditumpuk pula beberapa kertas peresap di atasnya.  Buffer kemudian akan mengalir pelan-pelan ke membran, demikian pula dengan gel yang membawa molekul ke kertas membran, sementara gelnya diserap oleh kertas peresap. Fragmen DNA yang spesifik dideteksi dengan menggunakan pelacak. Pelacak biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida. Lokasi sinyal yang terlihat setelah autradiografi membuat kita dapat menentukan ukuran dari fragmen DNA tersebut.

Telah dilakukan pembacaan seluruh basa dari gen (ORF) yang bertanggung jawab terhadap resistensi mutan K.pneumoniae KSL19 terhadap BRL41897A dengan panjang 234 basa. Ternyata didepan ORF didahului dengan rangkaian Signal peptida. Hasil transformasi K.pneumonie M10 dengan plasmid yang membawa seluruh gen M19, yaitu T19 mengubah mutan KSL19 menjadi lebih sensitifterhadap antibiotika tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

Basker,M.J., Edmonson,R.A., Knott,S.J., Ponsford,R.J., Slocombe,B. and White,S.S. 1984. In vitro

antibacterial properties of BRL36650, a novel 6 α – substituted penicillin Antimicrob. Ag.Chemother., 26:734-740.

Basker,M.J., Branch,C.L., Finch,S.C., Guest,A.W., Milner,P.H., Pearson, M.J,Ponsford, R.J. and

Smak, T.C. 1986. Studies on semi-synthetic 7 α – formamido – cephalosporin. J.Antibiotics.

39(12):1788-1791.

Brown, T.A.1993. Recombination. In Genetics molecular approach. Chapman & Hall. London. :207-212.

Critchley, I.A., Baker, M.J., Edmondson, R.A. and Knott, S.J. 1991. Uptake of a catecholic

cephalosporin by iron transport system of E.coli. J.Antimicrob. Chemother., 28:377-388.

Molecular Station , 2007 ., google.com

http://grace25041989.spaces.live.com/

 

About bondaneddyana

Menyukai membuat laporan, presentasi kegiatan atau laporan, penghitungan data - data

Discussion

No comments yet.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: